Medicina de Precisão: Aplicação clínica da biópsia líquida para diagnóstico de câncer de orofaringe induzido por HPV

Resumo: Introdução: Os tumores de orofaringe induzidos pelo HPV são reconhecidos como um tipo biológico distinto de câncer de cabeça e pescoço e apresentam melhor resposta ao tratamento e prognóstico mais favorável, quando comparados aos tumores não induzidos pelo HPV. A última edição do American Joint Committee on Cancer Staging Manual recomenda o estadiamento diferenciado do carcinoma epidermóide de orofaringe (CEO) relacionado ao HPV. Para isso, o College of American Pathologists (CAP) elaborou um protocolo que tem sido recomendado internacionalmente para identificar CEO HPV positivo e direcionar a conduta clínica para o tratamento desses tumores. Este protocolo recomenda que o status da infecção pelo HPV em amostras de tecido tumoral seja realizada pela técnica de imunohistoquímica para avaliar a expressão da proteína p16 (p16-IHC). Considerado um marcador substituto para detecção de HPV, a superexpressão deste marcador ocorre quando há mudanças nas vias que regulam o ciclo celular. No entanto, por não ser um teste específico, a p16-IHC precisa ser acompanhada de testes específicos para confirmar o diagnóstico do CEO. Assim, considerando a recomendação do CAP de analisar o status da infecção pelo HPV em espécimes clínicos de PAAF, vários estudos têm sido desenvolvidos para avaliar a confiabilidade da p16-IHC nestas amostras. No entanto, embora haja boa concordância entre a expressão de p16 em cell blocks e tecido tumoral obtido de biópsia ou de ressecção cirúrgica, muitas vezes a natureza escassa e degenerada do material contido no cell block pode levar a taxas de falso-negativo de até 21% e sensibilidade <70% caso seja aplicado o mesmo critério rigoroso utilizado para tecidos. Dessa forma, fica evidente a necessidade de padronização e validação da p16-IHC em cell block para uso na rotina clínica. Por outro lado, estudos utilizando plataformas automatizadas disponíveis para análise de amostras ginecológicas têm sido realizados em ensaios de base líquida para detecção de HPV em linfonodos cervicais, com resultados promissores de 70% a 100% de concordância comparados às técnicas de hibridização in situ e p16-IHC em amostras histológicas correspondentes. No entanto, essas plataformas são validadas para uso em amostras ginecológicas, e são necessários estudos para confirmar sua efetividade em amostras de CCP a fim de requererem autorização dos órgãos regulatórios. Objetivo: O objetivo deste projeto é identificar a técnica que apresenta maior sensibilidade e especificidade para detecção de HPV de alto risco oncogênico em espécime clínico proveniente da punção aspirativa por agulha fina em linfonodos cervicais metastáticos de pacientes com carcinoma epidermoide de orofaringe e com carcinoma epidermoide metastático de tumor primário oculto, validando seu emprego na rotina clínica a fim de fornecer um diagnóstico preciso para direcionar a conduta a ser adotada para o tratamento destes tumores. Material e Métodos: Trata-se de um estudo observacional transversal, onde serão utilizadas amostras biológicas e dados clínicos de pacientes submetidos à punção aspirativa por agulha fina (PAAF) no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital Universitário Cassiano Antonio de Moraes (HUCAM), Universidade Federal do Espírito Santo, no período de 2023 a 2025. Serão incluídos indivíduos de ambos os sexos, grupos étnicos, com idade acima de 18 anos com diagnóstico de metástase linfonodal de carcinoma epidermoide de orofaringe ou com lesões suspeitas destes tumores, além de pacientes com carcinoma epidermoide metastático de tumor primário oculto serão incluídos no estudo. Indivíduos submetidos à PAAF cuja metástase linfonodal não foi confirmada, ou aqueles com metástases linfonodais originadas de sítios primários de outras localizações anatômicas serão excluídos do grupo amostral. As variáveis clínicas topografia e tipo histológico do tumor primário, definidas pela Classificação Internacional das Doenças (CID) e o estadiamento clínico do tumor, definido de acordo com o a Classificação TNM de Tumores Malignos, e as variáveis sócio-demográficas referentes à idade, sexo e exposição a fatores de risco serão obtidas dos formulários encaminhados para citopatologia ou busca ativa em prontuários. Na metodologia proposta iremos padronizar as amostras de PAAF de linfonodos cervicais metastáticos uma vez que apresentam celularidade limitada, e utilizar o sobrenadante que, embora tipicamente descartado, representa um recurso potencialmente valioso para obtenção de DNA e RNA celular. Assim, as amostras de PAAF serão processadas para obtenção de sobrenadante e precipitado de células. O sobrenadante, que é a base da biópsia líquida, será submetido à extração de ácidos nucléicos e analisado pelas técnicas de droplet digital PCR (ddPCR) para detecção de DNA de HPV, que é um método recente, ultrassensível e preciso que permite a detecção de DNA viral mesmo em baixo número de cópias; e a técnica de real-time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), considerada 'padrão-ouro' na identificação da infecção do HPV transcricionalmente ativo. O precipitado de células será submetido às técnicas de p16-IHC e hibridização in situ utilizando sondas de RNA para detecção de HPV. Esta técnica está emergindo como um teste promissor para detecção de HPV em tecido tumoral e cell blocks sendo capaz de detectar até mesmo RNA fragmentado, apresentando alta sensibilidade e especificidade. Nosso grupo tem sido pioneiro no Brasil na realização desta técnica em tecido tumoral para detecção dos HPV. No entanto, o emprego desta técnica em cell block requer validação a fim de tornar este método confiável e amplamente disponível para uso na prática clínica. Os resultados obtidos a partir das análises de ddPCR e RT-PCR por biópsia líquida, e HPV E6/E7 mRNA ISH, realizada no precipitado celular, serão comparados com os resultados obtidos pela técnica p16-IHC em cell block, disponível na prática clínica e recomendada pelo protocolo CAP. A associação entre as variáveis clínico-patológicas será realizada utilizando o teste exato de Fisher ou o teste do Qui-quadrado. A precisão diagnóstica geral de cada técnica será calculada através da plotagem de uma curva ROC (Receiver Operating Characteristic) para cada teste, utilizando como teste referência a imunohistoquímica do p16. Resultados esperados: Esperamos com os resultados desta pesquisa: identificar a melhor técnica de detecção de HPV de alto risco oncogênico para emprego na rotina clínica como método auxiliar ao diagnóstico das metástases linfonodais na região cervical, bem como para uso complementar ao diagnóstico dos tumores primários ocultos da região de cabeça e pescoço; avaliar o potencial da biópsia líquida, utilizando o sobrenadante da amostra clínica que é geralmente considerado um resíduo, como um meio viável para diagnóstico molecular de pequenas amostras citológicas; identificar e validar técnicas modernas no diagnóstico destes tumores que tragam praticidade para a rotina, menores chances de erro, amostras mais puras e com maior rendimento quando comparado ao processo realizado manualmente, com rapidez e sem a necessidade de acompanhamento do usuário durante a execução e sem desperdício de reagentes.

Data de início: 28/11/2025
Prazo (meses): 24

Participantes:

Papel	Nome
Coordenador	SANDRA LÚCIA VENTORIN VON ZEIDLER
Pesquisador	RICARDO MAI ROCHA
Vice-Coordenador	ISABELLA BITTENCOURT DO VALLE