Variabilidade genética em NOTCH1: associação com o excesso de
peso e implicações terapêuticas na Leucemia Linfocítica Crônica
em idosos

Nome: Estevão Carlos Silva Barcelos
Tipo: Tese de doutorado
Data de publicação: 03/09/2021
Orientador:

Nomeordem decrescente Papel
Flavia I. V. Errera (M) Co-orientador
Sandra Lúcia Ventorin von Zeidler Orientador

Banca:

Nomeordem decrescente Papel
Breno Valentim Nogueira Examinador Interno
Carlos Magno da Costa Maranduba Examinador Externo
Flavia de Paula (M/D) Examinador Interno
Flavia I. V. Errera (M) Coorientador
MICHEL SATYA NASLAVSKY Examinador Externo
Sandra Lúcia Ventorin von Zeidler Orientador

Resumo: NOTCH1 é fundamental para a manutenção de células-tronco e tecidos adultos, e parece atuar como molécula chave no envelhecimento e em diversas condições crônicas, incluindo a obesidade e o câncer, em especial a Leucemia Linfocítica Crônica (LLC). Recentemente, a via de sinalização de NOTCH1 vêm
sendo apontada como fundamental na homeostase de adipócitos, além de estar diretamente ligada ao processo inflamatório. Além disso, a ativação constitutiva da sinalização de NOTCH1 está associada ao mau prognóstico em alguns tipos de câncer, como na LLC onde mutações recorrentes de NOTCH1 são responsáveis
pela estabilização do estado de sinalização. Dado o envolvimento do gene NOTCH1 no metabolismo e desenvolvimento celular, a hipótese do presente estudo é que variações genéticas de NOTCH1 estão associadas ao aumento do risco para o excesso de peso (sobrepeso e obesidade) e também alteram a resposta de células de LLC ao estresse provocado por fármacos. Portanto, como primeiro objetivo,
investigamos se variações genéticas em NOTCH1 estão associadas ao sobrepeso / obesidade em uma coorte de idosos brasileira. Para avaliar a associação dos polimorfismos de NOTCH1 e o sobrepeso / obesidade, dados antropométricos, bioquímicos, histórico médico e estilo de vida foram coletados. Foram analisados dados de sequenciamento de 1.024 indivíduos (de 59 a 99 anos): 424 apresentavam sobrepeso, 320 obesidade e 280 peso normal. Analisamos cento e sessenta e um tag SNPs abrangendo todo o gene NOTCH1 e bordas através da abordagem de tagging SNP (frequência de alelo menor≥0,01 e desequilíbrio de ligação par a par r 2 ≥0,8). Observamos a associação do SNP rs9411207 com risco de sobrepeso / obesidade sob o modelo aditivo, e a distribuição do genótipo mostrou aumento da frequência de TT homozigoto (OR = 1,50, IC 95%: 1,20-1,88; P = 0,0002). O haplótipo GAT construído a partir deste e de outros SNPs em alto desequilíbrio de ligação (DL) foi mais frequente em indivíduos com sobrepeso / obesidade (P = 0,003). A análise in silico sugeriu que esses SNPs provavelmente afetam a transcrição de NOTCH1 e outros genes. Este é o primeiro estudo relatando a associação entre SNPs de NOTCH1 e risco de sobrepeso / obesidade. Considerando a possibilidade de modulação de NOTCH1, estudos populacionais adicionais são necessários para replicar esses resultados e confirmar a utilidade desses genótipos de risco para novas estratégias terapêuticas. Um segundo objetivo foi avaliar se a mutação no gene NOTCH1 e a desregulação da via NOTCH1 em casos de LLC alteram a resposta à curcumina. Para isso, investigamos o efeito antiLLC da curcumina e sua capacidade de interferir na resposta integrada ao estresse (ISR) e na via de sinalização NOTCH1 em células primárias de LLC com mutação no gene NOTCH1 e no modelo murino de LLC Eμ-TCL1. Inicialmente, foram analisados dados de expressão gênica de células com mutação c.7544-7545 delCT em NOTCH1 em confronto com dados de células Wild-Type (WT). A analise in silico da expressão gênica das células de LLC muatadas em NOTCH1 mostrou um aumento na expressão de genes envolvidos no estresse de Retículo Endoplasmático (RE) e ISR. Células primárias de LLC foram coletadas e cultivadas com curcumina, um composto natural que também tem como alvo o estresse do RE, para posterior análise em Western blotting e PCR em tempo real. Após a exposição in vitro à curcumina, foram observados mecanismos relacionados ao estresse nas células primárias com NOTCH1 mutado em comparação com células WT. Essa resposta foi precedida por aumento precoce de Ca2+ no citoplasma das células de LLC mutadas em NOTCH1, o qual pode desencadear e manter o estresse de RE. Além disso, a curcumina aumentou a apoptose das células de LLC portadoras da mutação em NOTCH1, independentemente da carga alélica, quando comparada com células WT. A sinalização de NOTCH1 também aparece modulada após a exposição à curcumina. Em particular, as células de LLC mutadas em NOTCH1 mostraram redução na porção ativa de NOTCH1 (ICN1) e nas proteínas anti-apoptóticas da família BCL2 (BCL2 e MCL1), sendo que a combinação de curcumina com o venetoclax, um anti-BCL2, mostrou ter um efeito sinérgico em células de LLC. Além disso, utilizamos o modelo murino Eμ-TCL1 para avaliação do tratamento com a curcumina. A administração in vivo de curcumina no modelo Eμ-TCL1 reduziu significativamente a porcentagem de células leucêmicas CD5+ /CD19+ infiltrantes no fígado, baço e na medula óssea, com inibição concomitante da sinalização de NOTCH1 em células leucêmicas na medula óssea. Nossos resultados sugerem que a ativação de ISR induzida pelo estresse de RE e a inibição da sinalização de NOTCH1 convergem para a amplificação da morte de células de LLC e fornecem um alvo crucial para o tratamento de LLC.

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