Detecção do vírus da meleira do mamoeiro por PCR convencional e em tempo real e avaliação da transmissão por sementes
Nome: JOÃO GILBERTO ZANOTELLI PICCIN
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 29/03/2010
Orientador:
| Nome | Papel |
|---|---|
| PATRICIA MACHADO BUENO FERNANDES (M/D) | Orientador |
Banca:
| Nome | Papel |
|---|---|
| JOSE AIRES VENTURA (M/D) | Coorientador |
| ADRIANA SILVA HEMERLY | Examinador Externo |
| MARIA DO CARMO PIMENTEL BATITUCCI | Examinador Interno |
| PATRICIA MACHADO BUENO FERNANDES (M/D) | Orientador |
Resumo: O mamão (Carica papaya L.) figura entre as principais frutas tropicais comercializadas internacionalmente. O Brasil ocupa a segunda posição na produção global de mamão e o Espírito Santo é o maior exportador do país. As viroses constituem o principal grupo de doenças do mamoeiro. No Brasil as viroses mais importantes são os Papaya ringspot virus (PRSV-p) e o Papaya meleira virus (PMeV). Esta última é a virose mais importante economicamente no Estado do Espírito santo e causa a doença da meleira do mamoeiro.Inicialmente, objetivou-se estabelecer dois métodos de detecção precoce do PMeV a partir de folhas do mamoeiro. Compararam-se quatro métodos de extração de ácidos nucléicos em folha. O método que empregou lise celular por trituração com grau e pistilo foi o mais eficiente na quantidade e pureza de ácido nucléico extraído. Em seguida,utilizando-se o método de extração que apresentou maior eficiência, foi desenvolvido um protocolo de detecção do PMeV por RT-PCR convencional e um por RT-PCR em tempo real. O protocolo de detecção por RT-PCR convencional amplificou um fragmento de 303 pb em amostras que continham o PMeV e não amplificou nenhum fragmento em plantas sadias. Similarmente, o protocolo de detecção do PMeV por RT-PCR em tempo real obteve um aumento na fluorescência superando o ciclo limiar apenas na amostra de folha que continha o PMeV. Posteriormente, confirmou-se pela curva de fusão a especificidade da amplificação do PMeV. Visando estabelecer a sensibilidade e eficiência dos métodos de detecção propostos, realizou-se a comparação de quatro métodos de detecção da doença da meleira, três deles moleculares e um baseado na visualização dos sintomas no campo. Os métodos de detecção por RT-PCR convencional e em tempo real apresentaram resultados semelhante de sensibilidade e eficiência, enquanto a observação dos sintomas da doença no campo e o método de visualização do genoma do PMeV diretamente em gel de agarose foram menos eficientes e sensíveis. A avaliação da transmissão do PMeV por sementes por RT-PCR convencional não detectou esse vírus no material vegetal analisado. Os métodos de detecção por RT-PCR convencional e RT-PCR em tempo real a partir de folhas são eficientes na detecção precoce do PMeV independente do estágio de desenvolvimento da planta, além disso o PMeV não é transmitido por sementes ou é transmitido em uma freqüência baixa.
