Extração e purificação de bromelina do caule do abacaxizeiro (Ananas comosus var. comosus) cv. Vitória
Nome: HELBER BARCELLOS DA COSTA
Tipo: Dissertação de mestrado acadêmico
Data de publicação: 12/02/2010
Orientador:
Nome |
Papel |
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| JOSE AIRES VENTURA (M/D) | Orientador |
Banca:
| Nome |
Papel |
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| ANTONIO ALBERTO RIBEIRO FERNANDES | Examinador Interno |
| JOSE AIRES VENTURA (M/D) | Orientador |
| JUNE FERREIRA MAIA | Examinador Externo |
| PATRICIA MACHADO BUENO FERNANDES (M/D) | Coorientador |
Resumo: O Brasil ocupa o primeiro lugar na produção mundial de abacaxi (Ananas comosus var. comosus). O desenvolvimento de novas
variedades resistentes a doenças contribui para o avanço desta produção, destacando-se a cultivar Vitória, resistente à fusariose, doença causada pelo fungo Fusarium subglutinans f. sp. ananas Ventura, Zambolim & Gilb. (Sin.: Fusarium guttiforme), e que ocasiona perdas estimadas em mais de 30% da produção brasileira. A abacaxicultura gera grande quantidade de resíduos agrícolas que apresentam altos teores de bromelina, uma mistura de enzimas proteolíticas, com relevância biotecnológica na indústria alimentícia e farmacêutica. Este trabalho teve como objetivo comparar diferentes métodos para extrair e purificar a bromelina do caule de restos culturais da cv. Vitória após a colheita dos frutos. Na comparação entre diferentes tampões de extração, o que apresentou maior rendimento de proteínas totais e atividade proteolítica foi H2SO4/Na2SO4 pH 4,5. Na precipitação fracionada, as frações 20-50 % (F2S) e 50-75 % (F3S) de saturação por sulfato de amônio renderam maiores valores de atividade proteolítica; 88,57 % e 98,42 % respectivamente, quando comparadas a precipitação por acetona gelada. Na continuação da purificação, a F3S foi aplicada em diferentes resinas de troca iônica e observou-se que carboximetilcelulose (CMC) manteve os valores de atividade proteolítica mais elevados (89,31%). Visando a redução dos passos de purificação, o extrato bruto foi aplicado sem a precipitação salina, na coluna de CMC, como etapa única de purificação da bromelina e foi observado que esta técnica torna a proteína 3,01 vezes mais pura, com um rendimento de 93 % em atividade, podendo ser uma metodologia viável a depender do objetivo a que se pretende utilizar a bromelina, uma vez que o SDS-PAGE e o HPLC revelaram a presença de possíveis proteínas contaminantes. Após a passagem em CMC, as frações foram coletadas, reunidas e então eluídas em uma coluna de exclusão molecular (Sephadex G-50), que apresentou um rendimento de atividade de 89%. A bromelina obtida apresentou 16,86 vezes mais pura que o extrato bruto. O SDS-PAGE revelou apenas uma banda em 30 KDa, e o HPLC apenas um pico eluído nos primeiros 10 minutos. A pureza da bromelina foi confirmada por espectrometria de massas MALDI-TOF-TOF, onde por fingerprint se determinaram dois peptídeos de razão m/z 951 e 1584, tendo 95-100 % de identidade com a bromelina, sendo assim determinada e purificada pela primeira vez esta enzima na cv. Vitória. A obtenção de bromelina nesta cultivar, resistente à doença, traz para os agricultores e agroindústria uma nova alternativa de geração de emprego e renda com o aproveitamento dos resíduos da abacaxicultura.. A metodologia de purificação desenvolvida é inovadora e economicamente mais viável comparada com as existentes.
Palavraschave: Biotecnologia, Ananas comosus, Enzimas proteolíticas
